Aussie pmn User Manual

Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch der Tierärztlichen Hochschule Hannover Beziehung

Inhaltsverzeichnis 3.5.4 Lösungen für die Durchflusszytometrie ... 64 3.5.4.1 Sheath fluid ...

Material und Methoden 72Blutprobe, nicht opsonisiert Plot 1 Plot 2 Plot 3 Plot 3 Abbildung 4a: Auswertung der Phago

Material und Methoden 73Blutprobe, opsonisiert Plot 1 Plot 2 Plot 3 Plot 3 Plot 3 Abbildung 4b: Auswertung der Phago

Material und Methoden 74Die vitalen PMN wurden nun in einem FL1-Histogramm dargestellt. Im Detektor FL1 wird der fluoreszierende Farbstoff FITC regis

Material und Methoden 753.7.3 Reagenzien DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma Aldrich Chemie GmbH (99H3655), MG = 78,13 g / mol Steimheim Luminol (5-ami

Material und Methoden 763.7.4.2 PMA-Lösung 3.7.4.2.1 Stammlösung Zur Herstellung einer Stammlösung wurden 5 mg PMA in 1 l DMSO gelöst und bei -18° C

Material und Methoden 77gebnisse in der Höhe von 0,0001 bis 5.000 RLU (relative light units) werden während des Messvorganges erfasst. Mit Hilfe der

Material und Methoden 78Unmittelbar nach dem Auftragen der Proben wurde die Platte in das Luminometer verbracht. Dort wurde die frisch angefertigte R

Material und Methoden 79Abbildung 5: Verlaufskurve einer Chemilumineszenzmessung, links aus einer Blut-zellsuspension, rechts aus einer Milchzellsus

Material und Methoden 80Zahl der PMN (bereinigt) = vitale PMN + 5 x vitale eosinophile Granulozyten Zuletzt wurde die unbereinigte CL-Aktivität durch

Material und Methoden 813.9 Versuche 3.9.1 Methodische Versuche zur Phagozytoseaktivität in Blut Eine grundlegende Methodenbeschreibung für diese Un

Inhaltsverzeichnis 3.7.4 Puffer und Lösungen ... 75 3.7.4.1 Luminollösung ...

Material und Methoden 82a) 4 Mio. Zellen / ml, b) 2 Mio. Zellen / ml oder c) 200.000 Zellen / ml eingesetzt. 3.9.1.3 Bakterienkonzentration

Material und Methoden 83Der Versuch wurde einmal wiederholt. Im Rahmen der Auswertung wurde der Frage-stellung nachgegangen, in welcher Gruppe die Un

Material und Methoden 84Zellkonzentration: Ansatz a: 4 Millionen Zellen / ml Ansatz b: 2 Millionen Zellen / ml Ansatz c: 1,3

Material und Methoden 853.9.2.6 pH-Wert Von den vier Versuchstieren wurden Blutzellen isoliert, um den Einfluss des pH-Wertes auf die Messung zu u

Material und Methoden 863.9.2.7 Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und aufbereiteter Zellsuspension Blutproben von den Tieren 1 b

Material und Methoden 87Probe 1: Arbeitslösung 1a Arbeitslösung 1b Probe 2: Arbeitslösung 2a Arbeitslösung 2b Nach der Messung wurde die Wiederho

Material und Methoden 88Die Laktationsnummern der Tiere sind der Tabelle 10 zu entnehmen. Unter den un-tersuchten Tieren befand sich eines innerhalb

Material und Methoden 89Die durchgeführten Untersuchungen sind detailliert in Tabelle 11 dargestellt. Die Be-stimmung der Phagozytoseaktivität erfolg

Material und Methoden 903.9.4 Versuch 2: Verlaufsuntersuchung 3.9.4.1 Tier- und Probenmaterial Um die Zellfunktionalität in der Frühlaktation und i

Material und Methoden 913.9.5 Versuch 3: Zusammenhang zwischen Kriterien der Zellfunktionali-tät und der Eutergesundheit, Betrachtung auf Tierebene

Inhaltsverzeichnis 3.9.3 Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch und Blut .

Material und Methoden 92Tabelle 13: Allgemeines zum Probenumfang von Versuch 3 Untersuchungen pro Tier Tierzahl Summe Blutproben Summe Milchproben1

Material und Methoden 93 Tabelle 15: Laktationstage der Versuchstiere aus Versuch 3, nach Tagesprobensätzen Tagesproben-sätze Laktations-tage Tages

Material und Methoden 943.9.5.2 Datengruppierung und statistische Auswertung Für die Auswertung des gesamten Datenumfanges wurden Tests auf Normalve

Material und Methoden 95 Tabelle 17: Datengruppierung in Versuch 3 Titel Gruppe n Selektionskriterien aus GruppeGruppen auf Basis der Zellzahl T1 T

Material und Methoden 963.9.6 Gesamtdatenbank: Zusammenhang zwischen Kriterien der Zell-funktionalität und der Eutergesundheit, Betrachtung auf Vier

Material und Methoden 97 Tabelle 18: Datengruppierung der Gesamtdatenbank Titel Gruppe n Selektionskriterien aus GruppeGruppen auf Basis der Zellza

98 4. Ergebnisse Die Untersuchungen wurden durchgeführt, um Zusammenhänge zwischen der Eu-tergesundheit und der Funktionalität von aus Blut und Mil

Ergebnisse 994.1.1 Inkubationszeit Wie in Abschnitt 3.9.1.1 beschrieben, wurde der Einfluss der Inkubationszeit auf das Ergebnis der Phagozytosemess

Ergebnisse 100200.000 Zellen / ml in der Probe (Ansatz c) war der Unterschied zwischen den opso-nisierten (o) und den nicht opsonisierten Proben (n)

Ergebnisse 101 Tabelle 21: Vergleich der Phagozytoseaktivität in Blut-PMN mit verschiedenen Bak-terienkonzentrationen in der Probe Bakterienkonz. 0

Inhaltsverzeichnis 4.2.4 Zellkonzentration ... 106 4.2.5 PMA-Konzentration

Ergebnisse 1024.2 Methodische Versuche zur CL-Aktivität in Blut In diesem Abschnitt wurde der Einfluss einzelner Parameter auf die CL-Aktivität ü-be

Ergebnisse 103Die Ergebnisse der Vitalitätsmessung im Durchflusszytometer (s. Abschnitt 3.5.8) ließen im FSC/SSC-Dot Plot erkennen, dass in den Probe

Ergebnisse 104Der erste Messwert der 30 Einzelwerte, die während der Chemilumineszenzmessung erhoben werden (s. 3.7.7), lag in den Ansätzen 3 häufig

Ergebnisse 105Tabelle 25 gibt die Werte der CL-Aktivität und der Vitalität zu allen Messzeitpunkten wieder. Abbildung 6: CL-Aktivität im zeitlichen

Ergebnisse 1064.2.4 Zellkonzentration Die Abhängigkeit der CL-Aktivität von der Zahl der Zellen in der Probe wurde unter-sucht (s. Abschnitt 3.9.2.4

Ergebnisse 107Abbildung 7: CL-Aktivität (unbereinigt) in Abhängigkeit von der Zellkonzentration, Versuchstag 1 4.2.5 PMA-Konzentration Mit dieser Un

Ergebnisse 108Eine graphische Darstellung der Ergebnisse des dritten Versuchstages befindet sich in Abbildung 8. Abbildung 8: Vergleich verschiedener

Ergebnisse 1094.2.6 pH-Wert Um den Einfluss des pH-Wertes in der Reaktionslösung (RL) auf die Messung der CL-Aktivität einordnen zu können, wurden di

Ergebnisse 1104.2.7 Messung der CL-Aktivität aus Vollblut, lysiertem Blut und aufberei-teter Zellsuspension Mit dieser Untersuchung sollte gestestet

Ergebnisse 111Für die Auswertung wurde der Parameter CL-Einheiten / 1 Million PMN verwendet. Aus den beiden Arbeitslösungen jeder Probe wurden Mittel

Inhaltsverzeichnis 4.5 Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tierebene ...

Ergebnisse 1124.3 Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Eu-terviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch und Blut Ziel der U

Ergebnisse 1134.3.2 Blutproben 4.3.2.1 Korrelationen 4.3.2.1.1 Vollblutuntersuchungen Tabelle 32 gibt Korrelationen zwischen dem Anteil PMN im Blut

Ergebnisse 1144.3.2.1.2 Zellfunktionalität in Blut In Tabelle 33 werden die Korrelationskoeffizienten der Parameter aus Blutproben untereinander dar

Ergebnisse 115 Tabelle 34: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Blut gewonne-nen Daten der Gruppen A, B und C Gruppe WBC PMN Eos

Ergebnisse 116 Tabelle 35: Signifikanzen von aus Blutproben gewonnenen Daten zwischen den Gruppen A bis C Gruppen WBC PMN Eos Lym M % n 1 / MFI

Ergebnisse 1174.3.3 Milchproben 4.3.3.1 Korrelationen 4.3.3.1.1 Eutergesundheit In Tabelle 36 sind die Korrelationskoeffizienten verschiedener Para

Ergebnisse 1184.3.3.1.2 Zelldifferentialbild in Milch In Tabelle 37 sind die Korrelationen verschiedener Parameter aus Milchproben zum Anteil PMN in

Ergebnisse 119 Tabelle 38: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter der Zellfunktiona-lität von aus Milch isolierten Zellen zueinander (

Ergebnisse 120 Tabelle 39: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Milchproben gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C Gruppe log SCC

Ergebnisse 121 Tabelle 40: Signifikanzen von aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den Gruppen A bis C Gruppen log SCC LF PMN M Lym M Makro M

Inhaltsverzeichnis 4.5.4.2 Milchproben ... 152 Gliederung s. Abschn

Ergebnisse 122sank der Prozentsatz aktiver Zellen ebenso wie der Wert 1 / MFI von Gruppe A bis Gruppe C signifikant ab (p < 0,01). Hinsichtlich d

Ergebnisse 1234.4 Versuch 2: Verlaufsuntersuchung Die Tiere 1 bis 8 wurden von der Abkalbung an in wöchentlichem Abstand zwischen elf und 13 Mal unt

Ergebnisse 124 Tabelle 41: Einteilung der Daten der gesunden Tiere nach Laktationswochen (W) Woche Laktations-tage n Woche Laktations-tage n W1 1 –

Ergebnisse 125Abbildung 10: Zellzahl im VAG im Laktationsverlauf von drei gesunden Tieren Abbildung 11: Verteilung der Zellarten in der Zellsuspens

Ergebnisse 126Abbildung 12: Phagozytoseaktivität von aus Milch isolierten Zellen im Verlauf der Laktationswochen W1 bis W14 von drei gesunden Tieren

Ergebnisse 1274.4.2 Tiere mit unspezifischer Mastitis oder Mastitis Drei Tiere gaben während des Untersuchungszeitraumes in mindestens einem Eu-terv

Ergebnisse 1284.4.2.3 Zellfunktionalität in Blut und Milch Die Phagozytoseaktivität stellte sich im Verlauf der Mastitis folgendermaßen dar: In de

Ergebnisse 129Abbildung 14: Anzahl somatischer Zellen im VAG aus gesunden und kranken Euter-vierteln von drei Tieren vor, während und nach einer Mas

Ergebnisse 130Abbildung 16: Anteil aktiver PMN in der Phagozytose aus Milch von gesunden und kranken Vierteln (V.) von drei Tieren im Verlauf einer

Ergebnisse 131Abbildung 18: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von PMN aus Blut und Milch von gesunden und kranken Vierteln von drei Tieren im Verlauf einer

Inhaltsverzeichnis 5. Diskussion ...171 5.1 Methodische Versuche zur Phagozytose- aktivität in Blut ...

Ergebnisse 1324.5 Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit an-hand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tier-ebene Für die Auswertung dieses V

Ergebnisse 133Abbildung 20: Gruppeneinteilung für Versuch 3; *Tps: Tagesprobensatz; SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG 4.5.1 Mehrfach untersuc

Ergebnisse 134 Tabelle 42: Signifikanzen der Blut- und Milchwerte zwischen den Tagen der mehr-fach untersuchten Tiere Parameter WBC PMN B CL-Akti-vi

Ergebnisse 135 Tabelle 43: Korrelationskoeffizienten (k) verschiedener Parameter aus Blutproben zum Anteil PMN in Blut (n = 69) Parameter k WBC 0,19

Ergebnisse 1364.5.2.1.2.1 Vollblutuntersuchungen Die Parameter WBC und eosinophile Granulozyten im Blut stiegen von Gruppe T1 bis Gruppe T3 an. Der A

Ergebnisse 137 Tabelle 46: Signifikanzen der Blutwerte zwischen den Gruppen T1 bis T3 Gruppen WBC PMN B Eos B Lym B CL-Akti-vität B log Max Time

Ergebnisse 138Tabelle 47 zeigt Korrelationen zwischen der Zellzahl und den erhobenen Parametern der Zelldifferenzierung sowie der Zellfunktionalität

Ergebnisse 1394.5.2.2.2 Gruppenvergleich Die Grunddaten der drei Gruppen T1, T2 und T3 der aus Milch gewonnenen Daten sind in Tabelle 50 aufgeführt.

Ergebnisse 140 Tabelle 50: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus Milch gewon-nenen Daten der Gruppen T1 bis T3 Gruppe log SCC log L

Ergebnisse 141 Tabelle 51: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den Gruppen T1, T2 und T3 Gruppen log SCC log LF log NAGase

Inhaltsverzeichnis 5.3 Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Euterviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch und Blut ...

Ergebnisse 1424.5.3.1 Kranke Viertel (T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400) Zunächst wurden die als krank eingestuften Viertel vergleichend ausgewer

Ergebnisse 143 Tabelle 53: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 Gruppe log

Ergebnisse 144 Tabelle 54: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen T2/100–400, T3/100–400 und T3/>400 Gruppen log SCC log LF log NAGas

Ergebnisse 1454.5.3.1.2.3 Zellfunktionalität in Milch Die CL-Aktivität in Milch (7.962 Einheiten / 1 Mio. PMN) sowie log Max (-0,62) der Gruppe T2/1

Ergebnisse 146 Tabelle 56: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der Gruppen T1/<25 und T2&3/<25 und Signifikanzen z

Ergebnisse 1474.5.3.2.2.2 Zelldifferentialbild in Milch Der Anteil PMN in Milch war mit 38,4 % in Gruppe T2&3/<25 signifikant höher (p < 0

Ergebnisse 148 Tabelle 57: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) der Milchparameter der Gruppen T2&3/<25 und T2&3/>100 und Signifi

Ergebnisse 1494.5.3.3.2.3 Zellfunktionalität in Milch Die Vitalität war in Gruppe T2&3/>100 mit 80,0 % signifikant höher als in Gruppe T2&

Ergebnisse 150 Tabelle 58: Struktur der Gruppen Kat1 bis Kat4 Gruppe n (Tiere) n (Viertel) Zellzahl / ml Bakteriologie Viertel Kat1 18 72 ≤ 100.0

Ergebnisse 151 Tabelle 59: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Blutwerte der Gruppen Kat1 bis Kat4 Gruppe WBC PMN B Eos B Lym B

Inhaltsverzeichnis 5.5 Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tierebene ...

Ergebnisse 1524.5.4.2 Milchproben Aus den Gruppen Kat1 bis Kat4 wurden für die Parameter der Milchproben Mittelwer-te und Standardabweichungen gebild

Ergebnisse 153 Tabelle 61: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der aus Milchproben erhobenen Daten der Gruppen Kat1 bis Kat4 Gruppe log SC

Ergebnisse 154 Tabelle 62: Signifikanzen der aus Milchproben gewonnenen Daten zwischen den Gruppen Kat1 bis Kat4 Gruppen log SCC log LF log NAGase

Ergebnisse 155Gruppe gebildet (Gruppe Kat4/>100 bzw. Kat4/<100). Die Daten dieser beiden Grup-pen wurden miteinander und mit denen aus Gruppe K

Ergebnisse 156 Tabelle 64: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der Gruppen Kat1, Kat4/<100 und Kat4/>100 Gruppe log

Ergebnisse 157 Tabelle 65: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen Kat1, Kat4/<100 und Kat4/>100 Gruppen log SCC log LF log NAGase

Ergebnisse 1584.6 Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesund-heit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Viertelebene Die Erstellung der

Ergebnisse 159Abbildung 22: Gruppeneinteilung der Gesamtdatenbank; SCC: Anzahl somatischer Zellen / ml VAG; CL: CL-Einheiten / 1 Mio. PMN 4.6.1 Gr

Ergebnisse 160 Tabelle 66: Einteilung der Gruppen V1 bis V4 auf Basis der Zellzahl im VAG Gruppe n Zellzahl / ml Milch V1 77 < 50.000 V2 18

Ergebnisse 1614.6.1.1.2 Zelldifferentialbild in Milch Korrelationen zwischen dem Anteil PMN in der Milchzellsuspension und den Parametern der CL-Akt

Inhaltsverzeichnis 5.6 Gesamtdatenbank: Beurteilung der Euter-gesundheit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Viertelebene ...

Ergebnisse 1624.6.1.2 Gruppenvergleich Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Parameter aus Milch sind nach Gruppen in Tabelle 70 darges

Ergebnisse 163 Tabelle 70: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der Gruppen V1 bis V4 Gruppe log SCC log LF PMN M Lym

Ergebnisse 164 Tabelle 71: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen V1 bis V4 Gruppen log SCC log LF PMN M Lym M Makro M V1 V2 *** n.

Ergebnisse 1654.6.2 Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M Die Datenbank wurde nach der Höhe der CL-Aktivität M gruppiert (s. Abbildung 22). Hierfür w

Ergebnisse 166 Tabelle 73: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von Milchwerten der Gruppen CL1 bis CL3 Gruppe log SCC log LF PMN M L

Ergebnisse 167 Tabelle 74: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL1, CL2 und CL3 Gruppen log SCC log LF PMN M Lym M Makro M CL1 CL2

Ergebnisse 1684.6.2.3 Zellfunktionalität in Milch Die Vitalität war in Gruppe CL1 (71,1 %) signifikant niedriger als in den anderen Gruppen. Die Wer

Ergebnisse 169 Tabelle 76: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) der Milchwerte der Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100 Gru

Ergebnisse 170 Tabelle 77: Signifikanzen der Milchwerte zwischen den Gruppen CL2/T<100, CL2/V<100 und CL2/V>100 Gruppen log SCC log LF

171 5. Diskussion Ziel der Arbeit war es, das mikroskopische Differentialzellbild aus Milch sowie die Parameter der Zellfunktionalität aus Blut und

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. Jörn Hamann 2. Gutachter: Apl.

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Chemische Abläufe des Respiratory Burst ...15 Abbildung 2: Untersuchungen aus B

Diskussion 172terschied erwünscht, der in Ansatz c (200.000 Zellen / ml) geringer als in den ande-ren Proben war. Unter Berücksichtigung niedrigzelli

Diskussion 173 Tabelle 78: Methodenvergleich Phagozytosebestimmung Immunologie – Merle Parameter Immunologie Merle Inkubation 60 Minuten 60 Minute

Diskussion 174sung ausgeschüttet werden. Die Ansätze 3 (38° C) wiesen oft Werte über 0 auf, wo-durch die Standardisierung der Messung behindert wurde

Diskussion 175lyser, mit dem die Zellkonzentration bestimmt wurde, ist im Bereich zwischen 2 und 10 x 106 Zellen mit einem Variationskoeffizienten un

Diskussion 176aus Blutzellsuspensionen untersucht (s. Abschnitt 4.2.6). Die Messungen mit einem pH-Wert von 10,8 ergaben etwa 10fach höhere Werte als

Diskussion 177Der mittlere Variationskoeffizient aus den vier Arbeitslösungen desselben Tieres (z. B. Proben 1a, 1b, 2a und 2b) lag mit 10,5 % mehr a

Diskussion 1785.3 Versuch 1: Einfluss der Zahl der erkrankten Eu-terviertel pro Kuh auf die Zellfunktionalität von PMN aus Milch und Blut 5.3.1 Blut

Diskussion 179seinen Untersuchungen die Parameter Max, Time und das Integral der Kurve (CL-Einheiten / 1 Mio. PMN) aus der CL-Messung im Blut erhob,

Diskussion 180Die Tiere der Gruppe A wurden anhand dieser Parameter als eutergesund bezeich-net (s. Tabelle 80). Anhand der Gruppenstruktur (Tiere mi

Diskussion 181gleich zu den Ergebnissen der Gruppen B und C wurde dennoch davon ausgegan-gen, dass in Gruppe A die Tiere eutergesund waren. Die Zell

Abbildungsverzeichnis Abbildung 18: CL-Aktivität / 1 Mio. PMN von PMN aus Blut und Milch von gesunden und kranken Vierteln von drei Tieren im Verla

Diskussion 182dass die hohen Korrelationen den Erwartungen entsprachen. Auch von LILIUS und PESONEN (1990) wurde schon festgestellt, dass die CL-Akti

Diskussion 183dieser Tiere war nicht beeinträchtigt, während die Tiere der Gruppe C sowohl allge-mein- als auch euterkrank waren. Da alle vier Euterv

Diskussion 1845.4 Versuch 2: Verlaufsuntersuchung 5.4.1 Eutergesunde Tiere 5.4.1.1 Zellzahl im VAG In den ersten drei Laktationswochen lagen die Ze

Diskussion 185rigen Wochen, ein weiterer Hinweis auf eine Auseinandersetzung mit Krankheitser-regern. Ab Woche W9 war die Aktivität der Zellen in den

Diskussion 1865.4.2.2 Zelldifferentialbild in Milch Bereits in Woche 0 lag der Prozentsatz PMN in der Milchzellsuspension der kranken Euterviertel

Diskussion 187zytierender Zellen als diejenigen aus kranken Vierteln. Die MFI, die für die Zahl der aufgenommenen Bakterien pro Zelle steht, war denn

Diskussion 188wie in kranken Vierteln ein drastisches Absinken der Werte in Woche 5. Diese Er-gebnisse deuten eine Abhängigkeit gesunder und kranker

Diskussion 1895.5 Versuch 3: Beurteilung der Eutergesundheit an-hand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Tier-ebene 5.5.1 Mehrfach untersucht

Diskussion 190Die Leukozytenzahl und das Zelldifferentialbild aus Blut bewegten sich in allen drei Gruppen innerhalb der jeweiligen physiologischen B

Diskussion 191Zellen / ml Milch (T2) bzw. über 400.000 Zellen / ml Milch (T3) enthielten. Die Tiere der Gruppen T2 und T3 wurden daher als euterkrank

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002)..

Diskussion 192et al. 2003; SCHRÖDER 2003) die dominierende Zellart darstellen. Die vorliegenden Zelldifferentialbilder der Gruppen T2 und T3 bestätig

Diskussion 1935.5.2.3 Folgerungen Anhand der für die Gruppenbildung vorgegebenen Zellzahlen (s. Abschnitte 3.9.5.2 und 4.5.2) konnten die Tiere der G

Diskussion 194Gemäß ihrer Definition (s. Abschnitt 4.5.3.1 & Abbildung 20) befanden sich die Zell-zahlen im VAG der Gruppen T2/100–400, T3/100–40

Diskussion 1955.5.3.2.2 Zelldifferentialbild in Milch Der Anteil PMN in Milch wies in Gruppe T2&3/<25 (38,4 %) signifikant höhere Werte (p &l

Diskussion 196des Euters vor Infektionen ausdrückt, so stand eindringenden Krankheitserregern in beiden Gruppen das gleiche Abwehrpotential gegenüber

Diskussion 197Gruppen T2 und T3 ließ Unterschiede in den Parametern der Zelldifferenzierung und der CL-Aktivität erkennen. Hier war, unabhängig vom Z

Diskussion 1985.5.4.1.2 Zellfunktionalität in Blut Die CL-Aktivität B lag in Gruppe Kat3 signifikant niedriger als in allen anderen Grup-pen (p <

Diskussion 199 Tabelle 83: Beurteilung der Eutergesundheit der Tiere in den Gruppen Kat1 bis Kat4 anhand der Parameter SCC, elektrische Leitfähigkeit

Diskussion 2005.5.4.2.3 Zellfunktionalität in Milch Anders als in den übrigen Parametern unterschieden sich die Vitalität sowie die CL-Aktivität zwi

Diskussion 201Tabelle 84: Beurteilung der Eutergesundheit der Viertel in den Gruppen Kat4/<100 und Kat4/>100 anhand der Parameter SCC, elektris

Tabellenverzeichnis Tabelle 22: Mittelwerte (X), Standardabweichungen (sd) und Variationskoeffizienten (VK) der Gruppen 1 und 2 (Versuch Zellisola

Diskussion 202stand eine weitere Aktivierung erfuhren. Konkrete Daten zu dieser Thematik sind aus keiner Veröffentlichung bekannt. 5.5.4.4 Folgerung

Diskussion 203der Tiere von Gruppe T2 deutete auf eine schlechtere Abwehrlage dieser Tiere hin, obwohl die Prozentsätze PMN der Gruppen T2 und T3 gle

Diskussion 204 Tabelle 85: Veränderungen ausgewählter Parameter in Milch kranker Tiere im Ver-gleich zu den Vierteln eutergesunder Tiere Parameter ge

Diskussion 2055.6 Gesamtdatenbank: Beurteilung der Eutergesund-heit anhand von Kriterien der Zellfunktionalität auf Viertelebene 5.6.1 Gruppen auf

Diskussion 2061981a; KURZHALS et al. 1985; SCHRÖDER 2003). Dies ließ sich anhand der positi-ven Korrelation zwischen diesen beiden Parametern nachvol

Diskussion 207Analog zu Zellzahl und PMN-Anteil stieg die CL-Aktivität in der Milchzellsuspension von Gruppe V1 zu Gruppe V4 an. Während die CL-Aktiv

Diskussion 2085.6.2 Gruppen auf Basis der CL-Aktivität M 5.6.2.1 Eutergesundheit Die Viertel wurden auf der Grundlage einer ansteigenden CL-Aktivitä

Diskussion 209et al. 1981a; KURZHALS et al. 1985; FOX et al. 1985), während neuere Veröffentli-chungen eine Dominanz des Lymphozytenanteils herausste

Diskussion 210ginn von Immunreaktionen gegen Erreger dar. In der Gruppe CL3 lagen die Parame-ter Zellzahl, PMN-Anteil und CL-Aktivität so hoch, dass

Diskussion 211Milchzellsuspensionen auf (p < 0,001). Das Zellbild in Gruppe CL2/T<100 gab mit 24,6 % PMN, 22,8 % Lymphozyten und 38,0 % Makrop

Tabellenverzeichnis Tabelle 39: Mittelwerte (X) und Standardabweichungen (sd) von aus Milchproben gewonnenen Daten der Gruppen A, B und C ...

Diskussion 2125.6.2.5 Folgerungen Anhand der Gruppierung der Daten nach der CL-Aktivität in Milch ließ sich erkennen, dass die CL-Aktivität zwar von

Diskussion 213reich geringgradiger Erkrankung von etwa 50.000 bis 200.000 Zellen / ml Milch an-zunehmen. Sowohl der Anteil PMN als auch die CL-Aktiv

Diskussion 2145.7 Forschungsergebnisse der eigenen Untersuchun-gen Abbildung 25 zeigt schematisiert die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Arbe

Diskussion 215Im Medium Milch konnten Zusammenhänge zwischen funktionellen Zelleigenschaf-ten und dem Gesundheitszustand des Euterviertels statistisc

216 Roswitha Merle: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer B

Zusammenfassung 217In einer wöchentlichen Verlaufsuntersuchung über die ersten drei Laktationsmonate (Versuch 2) wurden drei eutergesunde sowie drei

Zusammenfassung 218Milch stiegen der PMN-Anteil und die Zellaktivität in der Milchzellsuspension von mit-telgradig (SCC 100.000 – 400.000 Zellen / ml

219 Roswitha Merle: Relationships between udder health and functionality of bovine blood and milk leucocytes with special regard to the chemilumi-ne

Summary 220approx. 45 % to about 60 % cells in the non opsonisized tests) and CL activity (from approx. 1,000 to approx. 4,000 units / 1 million PMN)

Summary 221The evaluation of udder health on quarter level (n = 171 quarters) made clear that the cell activity in milk was enhanced with increasing

Tabellenverzeichnis Tabelle 58: Struktur der Gruppen Kat1 bis Kat4 ... 150 Tabelle 59: Mittelwerte

222 Roswitha Merle: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer B

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Quellenverzeichnis 235NEWBOULD, F. H. S. (1970): Enhancement of phagocytosis in bovine milk leukocytes in vitro. Can. J. comp. Med. 34, 261 – 264 N

Quellenverzeichnis 236PAAPE, M. J., U. R. H. MILLER (1988): Sources of variation introduced into a phagocytosis assay as a result of the isolation o

Quellenverzeichnis 237PAAPE, M. J., W. D. SCHULTZE, A. J. GUIDRY, W. M. KORTUM U. B. T. WEINLAND (1981B): Effect of an intramammary polyethylene dev

Quellenverzeichnis 238REICHMUTH, J. (1975): Somatic cell counting – interpretation of results. in: IDF-Bulletin Doc. 85, 93 – 109 RIOLLET, C., P.

Quellenverzeichnis 239RUSSELL, M. W., B. E. BROOKER U. B. REITER (1977): Electron microscopic observations of the interaction of casein micelles and

Quellenverzeichnis 240SCHRÖDER, A. (2003): Untersuchungen zum Zelldifferentialbild von Milch mit Hilfe monoklonaler Antikörper unter besonderer Berü

Quellenverzeichnis 241SMITS, E., C. BURVENICH, A. J. GUIDRY, R. HEYNEMAN U. A. MASSART-LEËN (1999): Diapedesis across mammary epithelium reduces pha

Abkürzungsverzeichnis Allgemeines: A. monodest. Aqua monodestillata A. tridest. Aqua tridestillata BAP Blutagarplatte BSA bovines Serumalbumin E. c

Quellenverzeichnis 242VANDEPUTTE-VAN MESSOM, G., C. BURVENICH, E. ROETS, A.-M. MASSART-LEËN, R. HEYNEMAN, W. D. J. KREMER U. A. BRAND (1993): Classi

Quellenverzeichnis 243WILLIAMS, M. R., N. CRAVEN, T. R. FIELD U. K. J. BUNCH (1985): The relationship between phagocytosis and intracellular killing

244 Danksagung Ich danke Herrn Prof. Hamann für die Überlassung des Themas und für die heraus-ragende fachliche Betreuung, die durch sein außergewöhnl

Danksagung 245Meinem lieben Lebensgefährten Manfred Krückeberg möchte ich nicht nur für die fachliche Betreuung der technischen Geräte und die geduld

Abkürzungsverzeichnis Phagozytose: % n Prozentsatz aktiver Zellen der nicht opsonisierten Proben bei der Phagozytose (s. 3.6.7) % o Prozentsatz akt

1 1. Einleitung Der Zellgehalt der Milch wird seit langem zur Beurteilung der Eutergesundheit heran-gezogen. Dabei wird ein Zellgehalt bis 100.000 Z

Meinen Eltern und meinem Sohn in Liebe gewidmet

Einleitung 2flüsse (z. B. Stoffwechsel, Hormonstatus, Arzneimittel) erschwerten jedoch bisher eine Etablierung des Verfahrens. Parallel zur Beurteil

3 2. Literaturübersicht 2.1 Mastitis – Ursachen und Diagnostik 2.1.1 Ursachen und Einteilung Die Mastitis ist eine Entzündung des Euters. Ihre Ursach

Literatur 4 Tabelle 1: Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Mastitis-Kategorisierung (HAMANN u. FEHLINGS 2002) Euterpath

Literatur 5zahl über 100.000 Zellen / ml Milch, so kann nicht mehr von normaler Sekretion ge-sprochen werden, sondern es liegt ein Entzündungsgescheh

Literatur 6als das Blut. Das jeweilige Konzentrationsgefälle wird durch die Blut-Milch-Schranke aufrechterhalten. Ist diese geschädigt, so gleichen s

Literatur 72.2 Somatische Zellen in der Milch 2.2.1 Zellarten In Milch finden sich verschiedene Zellarten, deren Morphologie im mikroskopischen Zell

Literatur 82.2.2 Zelldifferentialbild PAAPE et al. (1981a) haben folgende Differenzierung der somatischen Zellen in Milch aufgestellt: 60 % Makrophag

Literatur 9HALS et al. (1985) weist einen wesentlich höheren PMN-Anteil nach als die Studien anderer Autoren; nach LEITNER et al. (1999) überwiegen d

Literatur 10und der Entzündungszellen auf eine artifizielle Euterinfektion brach zwölf Stunden nach der Inokulation von 30 CFU Escherichia coli (E. c

Literatur 11rumkonzentration von 1 – 5 % im Milchserum vor, im Falle einer Mastitis steigt die Konzentration auf 3 – 12 % (CRAVEN u. WILLIAMS 1985).

Literatur 12mikrobizid wirken. Dazu gehören u. a. Lysozym, Laktoperoxidase, Laktoferrin und kationische Proteine (TARGOWSKI 1983; CRAVEN u. WILLIAMS

Literatur 13produzieren. Die Lymphozytenanteile in der Milch betragen etwa 50 % T-Lymphozyten und ca. 20 % B-Lymphozyten (CONCHA et al. 1978; TARGOWS

Literatur 142.3.1.3 Reifestadien, die zur Phagozytose befähigt sind Die verschiedenen Reifestadien von PMN aus dem Blut unterscheiden sich hinsicht-

Literatur 15 Tabelle 4: Chemische Reaktionen des Respiratory Burst Reaktion Enzym 2 O2 + NADPH 2 O2 + NADP+ + H+ NADPH-Oxidase 2

Literatur 16Das O2- wird nun mit Protonen zu Hydrogenperoxid (H2O2) und Wasser reduziert, entweder spontan oder katalysiert durch das Enzym Superoxid

Literatur 17vierung der NADPH-Oxidase führt. Sie ist von kurzer Dauer und kann ausschließlich durch die fortbestehende Bindung an das Stimulans aufre

Literatur 18DAHL 1983). Die Zugabe von MPO zu den Zellen der Patienten bewirkte eine Ant-wort in der CL-Messung. 2.4 Labordiagnostische Methoden 2.4

Literatur 19durch eine Lymphozytose aus (KRAFT u. DÜRR 1997). Erhöhte Zahlen der eosi-nophilen Granulozyten in Rinderblutproben sprechen für Parasito

Literatur 20Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben Autor Vorgehen zitiert von: Carlson u. Kaneko 1973 • 40 ml EDTA-Blut aufgete

Literatur 21 Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben Autor Vorgehen zitiert von: Roth u. Kae-berle 1981 • Zentrifugation der Zit

Roswitha Merle: Beziehungen zwischen Eutergesundheit und Funktionalität von aus Blut und Milch isolierten Leukozyten des Rindes unter besonderer B

Literatur 22 Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben Autor Vorgehen zitiert von: Hed et al. 1987 • 0,1 ml humanes EDTA-Blut • Ly

Literatur 23 Tabelle 5: Methoden zur Isolation von PMN aus Vollblutproben Autor Vorgehen zitiert von: Cooray 1996 • Verdünnung von heparinisiertem Vo

Literatur 24g-Zahl während der Zentrifugationsschritte und das verwendete Medium. Milchpro-ben mit variierenden Zellgehalten sowie der Verwendungszwe

Literatur 25 Tabelle 6: Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus Milchproben Autor Vorgehen zitiert von: Saad 1987 • Verdünnung von 20 – 25

Literatur 26 Tabelle 6: Methoden zur Isolation von somatischen Zellen aus Milchproben Autor Vorgehen zitiert von: Daley et al. 1991 • 250 ml Milch •

Literatur 272.4.3 Labordiagnostische Methoden zur Messung der Phagozytoseakti-vität von PMN Zur in vitro Messung der Phagozytoseaktivität wurden meh

Literatur 28entsprechend 78 %, 44 %, 72 %, 74 % bzw. 22 % der S. aureus (PAAPE et al. 1975). Die unterschiedlichen Ergebnisse liegen im Fetta

Literatur 29rien bestimmt. Benutzt wurde in dieser Untersuchung ein Zytofluorograf 50L mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm (SAAD u. HAGELTORN 1

Literatur 30 Tabelle 7: Verschiedene Techniken zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität von PMN im Vergleich Quelle Paape et al. 1975 Dulin et al.

Literatur 31 Tabelle 7: Verschiedene Techniken zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität von PMN im Vergleich Quelle Saad u. Hageltorn 1985 Fox u. Mc

Inhaltsverzeichnis 2.3 Funktionelle Eigenschaften der PMN ... 13 2.3.1 Phagozytose ...

Literatur 32 2.4.4 Labordiagnostische Methoden zur Messung der freien Sauerstoff-radikale Für die Messung der freien Sauerstoffradikale gibt es mehr

Literatur 332.4.4.2 ROS-Bildung Eine modernes Verfahren zur Messung der Respiratory-Burst-Aktivität ist die Be-stimmung der ROS-Bildung im Durchflu

Literatur 34Luminol sind die am besten untersuchten lichtbildenden Chemikalien. Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) ist eine Substanz, d

Literatur 35Unter Verwendung von Bakterien werden diese phagozytiert. Das ist der Grund, weshalb manche Autoren die Messung der CL-Aktivität als Phag

Literatur 36werden Lichtquanten durch zwei Photomultiplier in Elektronen umgewandelt und ge-zählt. Die Ausgabe des Messergebnisses erfolgt üblicherwe

Literatur 371983) über einen längeren Zeitraum hinweg durchgeführt. Das Luminometer besitzt eine lichtdichte Kammer, in der die Temperatur regulierba

Literatur 382.4.4.3.3.2 Makrophagen Makrophagen in der Zellsuspension aus Milch sind auch in der Lage, Sauerstoffradi-kale zu produzieren. Im Luminom

Literatur 39weitere Untersuchungen bestätigten, dass PMN aus der Milch weniger aktiv sind als solche aus dem Blut (DULIN et al. 1988; SMITS et al. 19

Literatur 40Mastitisprävalenz in Verbindung gebracht werden kann (s. Tabelle 7) (PAAPE et al. 1978). Zwischen Zellen aus niedrigzelliger Milch und Ze

Literatur 41wurden an aus Blut isolierten PMN durchgeführt. In aus Blut und aus Milch isolierten PMN kann in der Peripartalperiode eine minimale CL-A

Inhaltsverzeichnis 2.4.4.3.3 Einflussfaktoren auf die CL-Messung ... 37 2.4.4.3.3.1 Vitalität ...

Literatur 42In einem anderen Versuch wurden 12 Kühe kurz nach der Kalbung mit E. coli infiziert (DOSOGNE et al. 1997). Einige Tiere hatten prae infec

Literatur 432.5.6 Einfluss verschiedener Antibiotika auf die Zellfunktionalität von PMN aus Blut und Milch Einige Autoren untersuchten den Einfluss

Literatur 44nach der Infektion nur 50.000 Zellen / ml Milch aufwies, entwickelte eine akute Masti-tis. Dies deckt sich mit der Beobachtung (SCHALM et

Literatur 45In einer späteren Untersuchung dagegen manifestierte sich mit gleichem Ver-suchsaufbau in allen Vierteln eine Infektion mit S. aureus (SC

Literatur 46beit die Zellaktivität von Tieren mit chronischen, subklinischen Mastitiden unter mo-derat erhöhten Zellzahlen bestimmt. Die gegenseitig

47 3. Material und Methoden 3.1 Versuchstiere Für die methodischen Versuche mit Blutzellen (Abschnitte 3.9.1 und 3.9.2) wurden Tiere der Klinik für

Material und Methoden 48eine Gruppe im automatischen Melksystem. Im konventionellen Melksystem wurde zweimal täglich von 4.30 – 6.30 Uhr und von 14.3

Material und Methoden 49Die Blutentnahme an den Tieren aus dem Betrieb 1 erfolgte nach dem Melken und an den Tieren aus dem Betrieb 2 unmittelbar dav

Material und Methoden 50Abbildung 2: Untersuchungen aus Blut- und Milchproben 3.2.2.3 Viertelhandgemelk (VGH) Im Anschluss an die Entnahme des VAG er

Material und Methoden 513.3 Allgemeine Probenanalyse 3.3.1 Geräte Autoklav Varioklav® Dampfsterilisator H + P Labortechnik GmbH, Oberschleiß-heim Bl

Inhaltsverzeichnis 3.2 Probenahme ... 48 3.2.1 Blut ...

Material und Methoden 523.3.2 Glas- und Einmalartikel Glas- und Einmalartikel sind für alle Methoden an dieser Stelle beschrieben. Eindrückstopfen

Material und Methoden 53Standardtips, Eppendorf, Hamburg 2 – 200 µl 0030 000.870 50 – 1000 µl 0030 000.919 1 – 5 ml 0030 000.978 Transferpip

Material und Methoden 543.3.4 Medien, Puffer und Lösungen 3.3.4.1 Ethanol für die Desinfektion Zur Desinfektion der Zitzen und Punktionsstellen wur

Material und Methoden 55etwa 5 bis 8 Sekunden in die Lösungen 1, 2 und 3 getaucht und anschließend unter einem dünnen Wasserstrahl abgespült. 3.3.5.

Material und Methoden 563.3.6.3 NAGase Für diese Untersuchung wurde 1 ml des VAG verwendet, das bis zur Messung in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß eingef

Material und Methoden 57Elektrische Pipettierhilfe Hirschmann® Laborgeräte, Eberstadt pipetus® - akku Elektronische Mehrkanalpipette Eppendorf,

Material und Methoden 583.4.2 Glas- und Einmalartikel Deckgläschen 18 x 18 mm IDL (190001818), Nidderau Weitere verwendete Glas- und Einmalartikel

Material und Methoden 59Bestandteile: NaCl 137,0 µmol / ml KCl 2,7 µmol / ml Na2HPO4 8,1 µmol / ml KH2PO4

Material und Methoden 60nommen und verworfen. 1 ml Plasma wurden für die spätere Anfertigung der Milch-zellausstriche (siehe 3.4.6.2.1) in einem Eppe

Material und Methoden 613.4.5.2 Mikroskopische Differenzierung der Blutzellsuspension Aus der unverdünnten Zellsuspension wurde ein Ausstrich angefe

Inhaltsverzeichnis 3.4 Zellisolierung und mikroskopische Zelldifferenzierung der Zellsuspensionen ... 56 3.4.1 Geräte ...

Material und Methoden 623.4.6 Milch 3.4.6.1 Zellisolierung Auf durchgehende Eiskühlung der Proben und aller Lösungen bis zum Abschluss der Untersuchu

Material und Methoden 63Der letzte Zentrifugationsschritt verlief wie die vorhergegangenen, jedoch betrug die Beschleunigung lediglich 200xg. Das Pe

Material und Methoden 643.5 Vitalitätsbestimmung aus Blut- und Milchzellen 3.5.1 Geräte Hamburg MS 1 Minishaker IKA® Landgraf Laborgeräte OHG, Lang

Material und Methoden 653.5.4.2 Propidiumjodidlösung Als Stammlösung diente 1 mg / ml Propidiumjodid in PBS, welche bei -18° C gela-gert wurde. Die

Material und Methoden 66Die Auswertung einer Probe erfolgt, nachdem meist mehrere tausend Partikel dieser Probe gemessen wurden. Der an das System an

Material und Methoden 67in dem die Partikel als PJ-positiv (angefärbt) bezeichnet werden, wird der Anteil der fluoreszierenden Partikel (hier nur PMN

Material und Methoden 683.6 Phagozytoseaktivität aus Blut- und Milchzellen 3.6.1 Geräte Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Becton Dickinson, Heidelb

Material und Methoden 693.6.4 Medien 3.6.4.1 Gepooltes Rinderblutserum Serumblutproben von mindestens zehn Rindern wurden zentrifugiert (1400xg, 15 M

Material und Methoden 703.6.4.2.2 Arbeitslösung Unmittelbar vor Beginn der Phagozytosemessung wurden zwei verschiedene Arbeitslösungen vorbereitet: E

Material und Methoden 71Nach dem Aufrütteln wurde die Mikrotiterplatte in den 37° C-Wärmeschrank gegeben und eine Stunde inkubiert. Nach 30 Minuten w